Набор для клонирования ПЦР Thermo Scientific CloneJET, также доступный с клетками DH10B ( K123120 ), представляет собой усовершенствованную систему позитивного отбора для высокоэффективного клонирования продуктов ПЦР, полученных с помощью любой термостабильной ДНК-полимеразы. Можно клонировать любой другой фрагмент ДНК с тупыми или липкими концами. Он идеально подходит для фосфорилированных или нефосфорилированных фрагментов ДНК. Лигирование в прилагаемый вектор позитивного отбора занимает всего 5 минут, что дает более 99% рекомбинантных клонов. Продукты ПЦР с тупыми концами, полученные с помощью корректирующего фермента, лигируются непосредственно в вектор клонирования. Продукты ПЦР,

полученные либо с помощью некорректирующих ДНК-полимераз, либо смесей ДНК-полимераз, затупляются перед лигированием в течение 5 минут с помощью термостабильного фермента затупления ДНК, поставляемого с набором. Все распространенные лабораторные штаммы E. coli могут быть напрямую трансформированы продуктом лигирования.

Особенности

Набор для клонирования ПЦР CloneJET содержит новый, готовый к использованию вектор клонирования с положительным отбором pJET1.2/blunt. Вектор содержит ген летального рестрикционного фермента, который разрушается путем лигирования вставки ДНК в сайт клонирования. В результате только бактериальные клетки с рекомбинантными плазмидами способны образовывать колонии. Рециркуляризованные молекулы вектора pJET1.2/blunt, не имеющие вставки, экспрессируют летальный рестрикционный фермент, который убивает клетку-хозяина E. coli после трансформации. Этот положительный отбор значительно ускоряет процесс скрининга колоний и устраняет дополнительные затраты, необходимые для сине-белой селекции.

Для удобства картирования и манипуляции вставкой сайт множественного клонирования вектора клонирования pJET1.2/blunt содержит две последовательности распознавания BglII, которые фланкируют сайт вставки. Кроме того, вектор содержит промотор T7 для транскрипции in vitro и in vivo , а также секвенирования вставки.

Основные моменты

• Быстрота — ПЦР-клонирование всего за 5 минут
• Высочайшая эффективность — > 99% положительных клонов
• Отсутствие фонового клонирования — вектор положительного отбора
• Универсальность — идеально подходит для клонирования с тупым или липким концом
• Экономичность — отсутствие дорогостоящего сине-белого скрининга

Области применения

• Клонирование продуктов ПЦР с тупым концом или 3'-dA-хвостом размером до 10 кб
• Клонирование фрагментов ДНК, полученных с помощью рестриктаз
• Секвенирование клонированной ДНК
• Транскрипция клонированных вставок in vitro и in vivo с промотора T7

Включает

• Вектор клонирования pJET1.2/blunt
• ДНК-лигаза T4
• Реакционный буфер 2X
• Фермент затупления ДНК
• pJET1.2Праймер прямого секвенирования ( 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3') • Праймер обратного секвенирования
pJET1.2 ( ) • Контрольный продукт ПЦР • Вода, без нуклеазы • Подробный протокол Перед электропорацией всегда очищайте смесь лигирования на колонке, используя, например, набор для очистки ПЦР GeneJET #K0701 или хлороформ для ее извлечения. Электропорация ингибируется присутствием белков и солей в смеси. Сопутствующие товары Набор для клонирования ПЦР CloneJET Набор для быстрого восстановления концов ДНК5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3'