Для минимизации перекрестной реактивности эти целые антитела ослиного антикроличьего IgG были очищены аффинно и показывают минимальную перекрестную реактивность с сывороточными белками крупного рогатого скота, курицы, козы, морской свинки, хомяка, лошади, человека, мыши, крысы и овцы. Перекрестная адсорбция или предварительная адсорбция — это этап очистки для повышения специфичности антитела, что приводит к более высокой чувствительности и меньшему фоновому окрашиванию. Раствор вторичных антител пропускается через матрицу колонки, содержащую иммобилизованные сывороточные белки потенциально перекрестно-реагирующих видов. Только неспецифически связывающиеся вторичные антитела захватываются в колонке, а высокоспецифичные вторичные антитела проходят через нее. Преимущества этого дополнительного этапа очевидны в экспериментах по мультиплексированию/многоцветному окрашиванию (например, проточной цитометрии), где существует потенциальная перекрестная реактивность с другими первичными антителами, или в экспериментах по флуоресцентному окрашиванию тканей/клеток, где может присутствовать эндогенные иммуноглобулины.

Красители Alexa Fluor являются одними из самых надежных флуоресцентных красителей, доступных сегодня. Краситель Invitrogen™ Alexa Fluor 488 — яркий флуоресцентный краситель зеленого цвета с возбуждением, идеально подходящим для лазерной линии 488 нм. Для стабильной генерации сигнала при визуализации и проточной цитометрии краситель Alexa Fluor 488 нечувствителен к pH в широком молярном диапазоне. Зонды с высоким квантовым выходом флуоресценции и высокой фотостабильностью позволяют обнаруживать биологические структуры с низкой распространенностью с большой чувствительностью. Молекулы красителя Alexa Fluor 488 могут быть присоединены к белкам в высоких молярных соотношениях без значительного самогашения, что обеспечивает более яркие конъюгаты и более чувствительное обнаружение. Степень маркировки для каждого конъюгата обычно составляет 2–8 молекул флуорофора на молекулу IgG; точная степень маркировки указана в сертификате анализа для каждой партии продукта.

Использование растворов конъюгатов: Перед использованием отцентрифугируйте раствор конъюгата белка в течение короткого времени в микроцентрифуге; в эксперимент добавляйте только супернатант. Этот шаг поможет устранить любые белковые агрегаты, которые могли образоваться во время хранения, тем самым уменьшая неспецифическое фоновое окрашивание. Поскольку протоколы окрашивания различаются в зависимости от применения, соответствующее разбавление антитела следует определять эмпирически. Для антител, меченых флуорофором, конечная концентрация 1-10 мкг/мл должна быть удовлетворительной для большинства применений иммуногистохимии и проточной цитометрии.